Biologia

Técnica de PCR

A técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) permite multiplicar um trecho específico do DNA milhares de vezes sem a utilização de organismos vivos. Em poucas horas, com quantidades mínimas de material genético, é possível obter cópias suficientes que permitam detectar e analisar a sequência que é alvo do estudo.

Essa técnica é utilizada em laboratórios de investigação biológica e médica, com o objetivo de identificar doenças hereditárias, clonar genes, detectar organismos patogênicos, produzir organismos transgênicos, fazer teste de paternidade, entre outros.

É possível a amplificação de qualquer sequência de DNA obtida de amostras de sangue, urina, fragmentos de tecidos e também de micro-organismos, células animais ou vegetais, mesmo que com milhares de anos.

A reação baseia-se na função natural de uma enzima termoestável, chamada de taq DNA polimerase, extraída da bactéria Thermus aquaticus, uma extremófila encontrada em fontes hidrotermais. Esse fato é de extrema importância, uma vez que a reação se processa em um aparelho denominado termociclador, que aquece e esfria o material nele contido em ciclos de temperatura preestabelecidos.

Como é feita a técnica PCR passo a passo

O processo ocorre em três etapas, que em conjunto se designam como um ciclo que se repete um número específico de vezes:

  1. desnaturação das cadeias de DNA: em torno de 92 °C, as duas cadeias de DNA são separadas;
  2. hibridação (hibridização) ou anelamento dos primers: em torno de 55 °C, ocorre o emparelhamento dos iniciadores a um local específico da cadeia de DNA;
  3. extensão: em torno de 72°, a DNA polimerase sintetiza novas fitas de DNA complementar. Posteriormente, reinicia-se um novo ciclo.

A desnaturação separa a molécula de DNA em duas fitas de nucleotídeos e, a seguir, ocorre o anelamento dos primers (iniciadores).

Os primers são pequenas fitas de DNA complementares, que se ligam ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar. Como na desnaturação são formadas duas fitas molde por molécula de DNA, são necessários dois tipos de primers diferentes.

Note que os primers se pareiam (anelamento) no início da sequência da fita que se quer multiplicar.

Após a desnaturação das fitas-molde e pareamento dos primers, a enzima, representada em verde no esquema, adiciona os desoxirribonucleotídeos complementarmente às fitas-molde, produzindo duas moléculas de DNA.

Esquema geral, representando as etapas de um ciclo da PCR. A cada ciclo, o trecho específico da molécula de DNA dobra em quantidade.

A quantidade de DNA final segue uma função exponencial. A concentração final do DNA molde na solução é muito maior, da ordem de 235, do que a inicial, possibilitando a sua identificação.

A análise do resultado é feita por meio da eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.

Referência

  • USP: Técnicas de Biologia Molecular – http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=2153

Por: Wilson Teixeira Moutinho

Veja também: